Гуріна Н.М.1, Ніколаєв В.Г.1, Драннік Г.М.2
1.Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України
2.Національний медичний університет ім. О.О.Богомольца

Вступ

Розсіяний склероз (РС) – повільно прогресуюче демієлінізуюче захворювання центральної нервової системи, при якому лімфоцити (переважно Т-клітини) та макрофаги в зв’язку з характерним порушенням проникності гемато-енцефалічного бар’єру інфільтрують мозок та сприяють деструкції мієлінової оболонки, а, можливо, і спричиняють її. Захворювання характеризується розвитком чисельних склеротичних осередків переважно в білій речовині головного та спинного мозку та значними функціональними порушеннями. Деструкція мієлінової оболонки нервових волокон протікає на фоні послаблення синтетичних і активації аутолітичних процесів обміну білків, ліпідів та інших сполук, що приводить до накопичення в різних органах і тканинах надлишкової кількості продуктів деградації мієліна. Етіологія РС залишається невідомою, проте відповідно до основної гіпотези ведучою ланкою його патогенезу є аутоімунний процес, який безпосередньо пов’язаний з ранньою вірусною інфекцією. Тому головними засобами лікування РС на сьогодні залишаються імунотропні препарати – як імуносупресорні, так і імуностимулюючі. Водночас застосування фармакологічних препаратів не може повною мірою вирішити проблему зняття ознак ендогенної інтоксикації, яка супроводжує протікання РС і, в свою чергу, має безпосереднє відношення до виникнення та подальшого підтримання метаболічного пригнічення ланок імунної системи.
Дані по застосуванню гемосорбції в лікуванні ряду імунозалежних захворювань, а також позитивний результат використання обмінного плазмафереза та інших еферентних процедур в лікуванні демієлінізуючих захворювань дали підстави запропонувати гемосорбцію в якості метода лікування імунозалежних демієлінізуючих захворювань нервової системи. Більше того, перші спроби застосування гемосорбції в лікуванні РС підтвердили доцільність такого терапевтичного підходу .
Метою роботи було вивчення ефективності сорбційних методів з застосуванням вуглецевих адсорбентів при лікуванні РС в період загострення демієлінізуючого процесу.

Матеріали та методи

Обстежено 49 хворих на РС віком від 18 до 58 років (35 жінок та 14 чоловіків), які склали дві дослідні групи. У хворих першої групи (23 особи) загострення РС лікували гемосорбцією (ГС), у другої (26 осіб) – ентеросорбцією (ЕС). Тривалість захворювання на момент початку спостереження була від кількох місяців до 19 років. В першій групі 13 хворих мали тривалість РС менше 2-х років, а 10 – більше 2-х років; в другій групі відповідно – 14 та 12 осіб. Всі хворі страждали на цереброспінальну форму РС. Серед них у 33 пацієнтів діагностовано прогредієнтно-ремітуючий перебіг захворювання, у 12 – прогредієнтний та у 4 – початкову форму РС. Форму РС визначали на основі комплексу клінічних критеріїв.
Контрольні групи були аналогічні основним за віком, статтю, тривалістю, формою та перебігом захворювання; їх склали 27 хворих РС, які в стадії загострення захворювання отримували традиційну імуносупресивну терапію кортикостероїдними препаратами.
Неврологічні симптоми у хворих до та після лікування оцінювали за стобальною шкалою Sipe J.C. et al. [8]. В той же період визначали імунологічні та біохімічні показники крові паціентів.
Лімфоцити із периферичної крові хворих виділяли на градієнті щільності фіколл-верографіну. Для визначення вмісту Т- та В-лімфоцитів застосовували метод непрямої імунофлюорисценції з використанням моноклональних антитіл (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+) фірми «ДАКО» (Данія). Вміст імуноглобулінів класів A, G, M в сироватці крові хворих визначали методом радіальної імунодифузії за Mancini, використовуючи моноспецифічні анти-А-, анти-G-, анти-М-сироватки фірми «Sevac» (Чехія) та еталонну стандартну сироватку фірми «Boehringer» (Німеччина).
Компоненти молекулярної маси менше 10 кДа виділяли з плазми крові хворих та донорів (10 чоловік) методом ультрафільтрації на приборі моделі 8МС фірми «Amicon» (США) з використанням мембранних фільтрів РТ-10 («Amicon», США) з діапазоном пропускання пор до 10 кДа. Перед фільтрацією плазму розводили 0,2 М фосфатним буфером у 20 разів. Аналіз ультрафільтратів плазми проводили методом високоефективної рідинної хроматографії з використанням колонки «Protein-pak» 60 фірми «Millipore-Waters» (США).
Вміст білка в плазмі крові визначали за методом Lowry O. et al. , а вміст альбуміну – за Hill P. et al. Альбумінову фракцію з плазми виділяли шляхом висолювання сульфатом натрія з наступним діалізом проти води. Зв’язуючу здатність плазми та альбуміну по відношенню до гідрофобного маркера конго червоного виявляли за Чегером С.І.. Температуру денатурації альбуміна визначали методом диференціальної скануючої калориметрії на мікрокалориметрі ДСМ-4 ?14?. Визначення вмісту загальних ліпідів, загального холестерину та фосфоліпідів в сироватці виконували за допомогою стандартних наборів фірми «bioMerieux» (Франція).
ГС хворим проводили через гранульовані гемосорбенти марок СКН або СУГС по вено-венозній схемі з об’ємною швидкістю перфузії 60-70 мл/хв. Суммарний об’єм крові, яку пропускали через сорбент, становив 4-5 л. Сорбційну процедуру кожному хворому виконували 2-3 рази з інтервалом 7 днів. Для ЕС використовували таблетки з волокнистого сорбційного матеріалу АУВМ-Днепр МН в дозі 2,7 г на добу. Хворі приймали по 3 таблетки масою 0,3 г тричі на день в рівних проміжках між їдою. Курс ЕС тривав 21 день. Крім сорбційної терапії хворі основних груп отримували вітамінні препарати (В1, В6, С).
Вірогідність отриманих результатів оцінювали за t-критерієм Ст’юдента.

Результати та їх обговорення

З наведених в таблиці 1 даних випливає, що терапія з включенням сеансів ГС, або курсу ентеросорбції приводили до вираженого покращення неврологічного статусу хворих на РС. При цьому застосування сорбційних методів детоксикації для лікування давало змогу досягти швидкої регресії патологічних неврологічних симптомів, збільшити проміжок часу між рецедивами, зняти неврологічні розлади, які з’явилися у хворого під час останнього загострення хвороби, тобто вперше. Серед неврологічних симптомів, які в першу чергу піддавались регресії, слід відмітити: ністагм, окорухові розлади, девіацію язика, інтенціонний тремор при пальцьо-носовій пробі, атаксію при п’ятко-колінній пробі та при ході, слабкість та скованість в ногах, патологічні стопні симптоми, розлади функції тазових органів.
Максимальний позитивний ефект ГС спостерігався у хворих зі слабкими порушеннями неврологічних функцій на початковій стадії захворювання (до двох років), як правило, в дебюті або при першій екзацербації. Чіткий позитивний ефект, що характеризувався відновленням трофічних та рухових функцій, було відмічено у хворих з прогредієнтно-ремітуючим перебігом захворювання в стадії загострення. У хворих з прогредієнтним перебігом РС, які мали різко виражені порушення, відмічали або часткове відновлення трофічних та рухових функцій, або значне покращення трофічних без чіткого відновлення рухових функцій. У цих пацієнтів прояви стійких неврологічних симптомів, які вказують на ураження не тільки мієлінової оболонки, але й осьових циліндрів нервових провідників, повністю не знімались, а лише зменшувались. За звичай повністю знімались прояви тих неврологічних симптомів, що з’явились під час останнього загострення.
Подібні результати були досягнуті у хворих на РС, які отримували ентеросорбенти. Так, 21 денний курс лікування приводив до покращення неврологічного статусу хворих за шкалою Sipe J.C. et al. на 52 та 27% (р<0,05) відповідно у групі хворих, що мають термін захворювання до двох років та більше двох років (табл.1). Таблиця 1.
Вплив сорбційних методів лікування на вираженість неврологічних симптомів у хворих на РС (в балах за шкалою Sipe J.C. et al.; M?m)

Лікування гемосорбцією (ГС)

Тривалість захворювання

при прийомі до клініки

після 1-ї ГС

після 2-ї ГС

виписка з клініки

До 2х років

n

64,8±3,5

13

78,0±4,4*

13

83,2±4,6*

12

86,9±3,3*

13

Більше 2х років

n

47,4±4,8

10

57,7±5,5

10

74,5±4,7*

10

72,3±4,5*

10

Лікування ентеросорбцією (ЕС)

Тривалість захворювання

при прийомі до клініки

після курсу ЕС

До 2х років

n

52,0±3,4

14

79,0±3,0*

14

Більше 2х років

n

49,2±4,0

12

62,3±3,5*

12

Примітка: тут і в таблицях 2,3: * – вірогідність результатів, отриманих при обстеженні хворих на РС після лікування порівняно з результатами до лікування р<0,05.

Спостереження за хворими на протязі року після проведеного лікування показало, що ефект відновлення неврологічних функцій наростає протягом 1-2 місяців, після чого у більшості хворих (75%) відмічається стабілізація процесу, у іншої частини – деяке погіршення стану, проте не до рівня, який був перед лікуванням ГС або ЕС. Загострення захворювання в легкій формі в цей період виникло у 4 з 49 хворих, які були під наглядом.
У хворих контрольних груп, у яких регресії неврологічних симптомів захворювання досягали в результаті традиційного лікування стероїдними гормонами через декілька неділь від початку прийома препаратів, загострення, що не піддавались повторному курсу лікування тими ж дозами гормонів, відмічено в 50% випадків.
Динаміка неврологічних проявів у хворих на РС в процесі лікування супроводжувалась однонаправленими змінами імунологічних та біохімічних показників в обох дослідних групах. Тому надалі отримані лабораторні дані представлені як загальний результат сорбційної терапії у хворих на РС (табл.2, 3).
Дослідження стану імунної системи у хворих на РС не виявило значних змін за кількістю Т-клітин крові (CD3+) та концентрації імуноглобулінів в сироватці крові (табл.2). Проте під час загострення хвороби спостерігалось збільшення як абсолютної, так і відносної кількості В-клітин (CD19+). Не зважаючи на те, що в середньому кількість Т-хелперів (CD4+) та Т-супресорів (CD8+) у хворих на РС не зазнавала істотних змін, хелперно-супресорне співвідношення, розраховане за індивідуальними показниками, було знижене в порівнянні з встановленою нормою (табл.2). Ці результати вказують на існуючі порушення в популяції не лише Т-супресорів при РС, а й Т-хелперів. Однократна ГС або курс ЕС сприяли вірогідному збільшенню хелперно-супресорного співвідношення на 76%. Коригувальний вплив мали сорбційні методи терапії і на стан гуморальної ланки імунної системи. Як ГС, так і ЕС призводили до нормалізації кількості В-клітин в крові (р<0,05), але не викликали змін концентрації імуноглобулінів. Направленість змін вказаних імунологічних показників в контрольній групі хворих, які отримували традиційну терапію, була також позитивною, проте значно менш вираженою (табл.2).
Загострення РС супроводжувалось характерними змінами біохімічних показників, які є маркерами стану ендогенної інтоксикації в організмі людини. Так, в порівнянні з показниками донорів в плазмі крові хворих на РС відмічено підвищення на 89% (р<0,05) концентрації компонентів з молекулярною масою менше 10 кДа, зниження на 13% її зв’язуючої здатності по відношенню до маркерного барвника конго червоного і, перш за все, за рахунок зв’язуючої здатності альбумінової фракції – на 53% (р<0,05) (табл.3). Отримані дані свідчать про надлишкову завантаженість основного транспортного білка плазми крові
Таблиця 2.

Імунологічні показники хворих на РС до та після лікування (M?m)

Показники

Норма

До лікування

Після лікування сорбційними методами

Після лікування ртикостероїдами

CD3+,% x109

53,6±1,7 1,05±0,05

51,3±4,7 0,93±0,27

53,9±3,8
0,98±0,15

49,8±4,2
0,90±0,23

CD4+,%

34,0±1,42

22,4±1,6

24,6±1,7

20,9±2,1

CD8+,%

28,0±0,98

27,2±3,6

27,6±2,5

25,3±1,6

CD4+/CD8+

1,5-3,0

0,82±0,14

1,44±0,17*

1,22±0,20

CD19+,% x109

25,0±1,2 0,53±0,04

30,8±4,6
0,60±0,10

17,5±2,0*
0,31±0,07*

27,7±2,6
0,45±0,12

IgG, г/л

11,50±0,50

11,0±0,75

12,52±0,77

14,50±1,1

IgM, г/л

1,15±0,06

0,70±0,09

0,80±0,11

1,28±0,10*

IgA, г/л

1,90±0,08

2,41±0,25

2,28±0,26

2,50±0,36

продуктами метаболізму як гідрофільної, так і гідрофобної природи. Підтвердженням цьому є також дані отримані за допомогою методу диференціальної скануючої калориметрії, який дозволяє фіксувати найменші конформаційні зміни білка, спричинені взаємодією з різними лігандами ?14?. Альбумін, виділений з плазми крові хворих на РС, мав два піки денатурації на ендотермі плавлення при 69,8?С (слабо виражений) та 79,6?С (більше виражений), в той час як для донорського альбуміну характерним є більший за площею пік при 70,0?С і менший – при 80,1?С. Це вказує на певну термостабілізацію альбумінової фракції з плазми хворих за рахунок утворення комплексів альбумін-ліганд і підтверджує вище приведені дані про більшу завантаженість білка, а, внаслідок цього, обмежену можливість виконання ним транспортних функцій. Це, в свою чергу, сприяє наростанню проявів ендогенної інтоксикації. Загострення РС супроводжувалось також підвищенням на 50% (р<0,01) вмісту загальних ліпідів, на 77,7% (р<0,01) – фосфоліпідів та 29,3% (р<0,05) – загального холестерину в сироватці крові хворих (табл.3), що напевно пов’язано з посиленням процесу демієлінізації.
Таблиця 3.

Показники

Донори

До лікування

Після лікування сорбційними методами

Після лікування кортикостероїдами

Компоненти плазми крові з мол.масою <10 кДа (умов.од.x106)

2,49±0,22

4,71±0,50

3,03±0,54*

4,51±0,31

Зв’язуюча здатність плазми крові (мкг конго червоного/мг білка)

0,099±0,005

0,086±0,005

0,116±0,008*

0,089±0,006

Зв’язуюча здатність альбуміну (мкг конго червоного/мг білка)

0,170±0,026

0,080±0,005

0,153±0,006*

0,091±0,005

Температура піків денатурації альбумінової фракції (град.С)

70,0±0,3; 80,1±0,5

69,8±0,3; 79,6±0,8

70,1±0,3; 80,1±0,4

69,7±0,4; 79,6±0,5

Загальні ліпіди (г/л)

5,87±0,16

8,78±0,25

6,32±0,28*

7,94±0,28

Загальний холестерин (ммоль/л)

6,46±0,44

8,35±0,36

6,36±0,23*

7,34±0,30

Фосфоліпіди (ммоль/л)

2,50±0,14

4,44±0,25

3,47±0,18*

4,51±0,22

Після застосування сорбційної терапії спостерігали зниження вмісту компонентів середньої молекулярної маси в плазмі крові хворих на РС на 35,7% (р<0,05), підвищення здатності альбуміну до комплексоутворення з маркерним барвником конго червоним на 90% (р<0,05). Ендотерма плавлення альбуміну, виділеного з плазми крові після проведення сорбційної терапії, по своєму характеру наближалась до ендотерми альбуміну донорів і характеризувалась наявністю чітко вираженого максимума при температурі 70,1?С та слабо вираженого при 80,1?С. Незалежно від методу детоксикації (гемо- чи ентеросорбція) відмічено зниження вмісту загальних ліпідів сироватки крові в середньому на 28% (р<0,05), фосфоліпідів – на 22% (р<0,05) та загального холестерину – на 24% (р<0,05).
Поряд з цим в контрольній групі хворих, які отримували кортикостероїдні препарати, досліджені біохімічні параметри не зазнавали значних позитивних змін (табл.3). Тобто реалізація імуносупресивного механізму лікувальної дії гормонів відбувалась на фоні вираженої ендогенної інтоксикації, що має місце у хворих на РС.
Результати проведених досліджень свідчать, що при лікуванні РС сорбційними методами з використанням вуглецевих адсорбентів покращення неврологічного статусу хворих досягається за рахунок імунокоригувального та детоксикаційного ефектів. Вилучення з організму ряду метаболітів дає змогу зменшити навантаження на імунну систему. Поряд з можливістю прямого зв’язування сорбентом ендогенних токсичних продуктів, одним з механізмів зменшення метаболічної супресії при РС можна вважати підвищення комплексоутворюючої здатності основного транспортного білка крові альбуміна.

Висновки
1. Сорбційна терапія, яку застосовували в період загострення РС, призводила до значного покращення неврологічного статусу хворих – дозволяла купіювати патологічні симптоми, що з’явились вперше, та сприяла збільшенню тривалості ремісій.
2. Гемо- та ентеросорбція при РС мали імунокоригувальний ефект – сприяли нормалізації співвідношення Т-хелпери (CD4+)/Т-супресори (CD8+) та вмісту В-лімфоцитів в периферичній крові хворих.
3. Застосування гемо- та ентеросорбції при лікуванні хворих на РС призводило до зниження рівня компонентів середньої молекулярної маси, загальних ліпідів, холестерину та фосфоліпідів в плазмі та сироватці крові.
4. Внаслідок сорбційної терапії при РС підвищувалась зв’язуюча здатність альбуміна і як результат поновлювалась його транспортна функція.