НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Державна установа «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В.Громашевського (ДУ ІЕІХ НАМНУ)
03680, м.Київ, вул.Амосова, 5 (тел.044 275 37 11)
ЗАТВЕРДЖУЮ
Директор ДУ ІЕІХ НАМНУ
д.м.н.,проф.,чл.-кор.НАМНУ
________ В.І.Задорожна
«Вивчення антивірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді на моделі коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС)»
за договором № 13 від 24 березня 2020 р. з ТОВ «НАНОФЛЮЇД»
Керівник теми
Зав.лабор.експериментальної
хіміотерапії вірусних інфекцій
д.м.н., проф. С.Л. Рибалко
Київ – 2020
ВИКОНАВЦІ:
Рыбалко С.Л. д.м.н., проф.
Старосила Д.Б. к.б.н., ст.н.с.
Дерябин О.Н. н.с.
Валовая Е.Г. старший лаборант
Брушковская Л.В. препаратор
Мета дослідження: визначити антивірусну активність комбінованої наносуспензії срібла та міді на моделі коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС).
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Віруси:
ВТГС (TGEV) – етіологічний агент трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС) – висококонтагіозним кишковим захворюванням свиней.
Штам вірусу:
D52-5 (BRE79) – є високопатогенний вірус для свиней усіх вікових груп на рівні 5 пасажу в перещеплюваній моношаровій культурі клітин тестикул поросяти ST.
Показаний тропізм вірусу шлунково-кишкового тракту і респіраторного тракту. Штам надано доктором Hubert Laude з лабораторії молекулярної вірусології та імунології Центру біотехнології INRA в Жуа-ан-Жозасі (Франція).
Титрування інфекційності:
Титрування інфекційності вірусних матеріалів на культурах клітин проводили двома методами – кінцевих розведень по ЦПД (рис.1), а титр інфекційності визначали за методом Кербера-Ашмаріна і визначали в ТЦД 50/мл, методом негативних колоній (S-ознака) під 1,35 % агаровим покриттям (Difco-Bacto) (рис.2), а титр інфекційності визначали в БУО/мл. Результати обраховували через 120 годин культивування при 38°С.
Рис.1 Контроль культури СНЕВ
(перещеплювана культура клітин нирки свині)
Рис.2 Контроль вірусу на СНЕВ
(перещеплювана культура клітин нирки свині)
Вірус – вірус трансмісивного гастроентериту свиней (ВТГС) – коронавірус.
Культура клітин:
СНЕВ – перещеплювана культура клітин нирки ембріона свині
НСП – перещеплювана культура клітин нирки поросяти
ST – перещеплювана культура клітин тестикул поросят
КЩЗ – перещеплювана культура клітин щитовидної залози свині
Препарат: комбінована наносуспензія срібла та міді
Визначення цитотоксичної концентрації препаратів (СС50)
Для визначення СС50 препарату використовували культури клітин СНЕВ. У дослідах використовували не менше десяти рядів лунок в планшетах з культурою клітин для кожного розведення препарату у культуральному середовищі. Планшети з культурою клітин інкубували при 370С з подачею 5% СО2 протягом 5 днів. Щодня проводили спостереження за дослідними і контрольними зразками культур з метою встановлення наявності або відсутності цитопатогенної дії (ЦПД).
Ступінь ЦПД визначали по зміні морфології клітин (округлення, зморщування клітин, відторгнення від поверхні лунок дегенеративно змінених клітин по 4+ плюсовій системі від + до ++++:
«-» – повна відсутність дегенерації клітин;
«+» – уражено не більше 25% (захист клітин моношару від антивірусного препарату на 75%);
«++» – уражено не більше 50% клітинного моношару;
«+++» – уражено не більше 75% клітинного моношару;
«++++» – повна дегенерація клітинного моношару.
За СС50 препарату приймали його найбільшу кількість, яка не викликала дегенерацію клітин.
МТТ – метод дослідження життєздатності клітин
Цей метод базується на функціонуванні дегідрогеназної системи мітохондрій інтактних клітин, які в нормальних умовах перетворюють 3, (4,5 діметілтріазол-2-іл) -2,5- діфенілтетразоліумбромід (МТТ) в формазан. Продукт реакції можна визначити кількісно спектрофотометричним методом. Перетворення МТТ у формазан зменшується при загибелі клітин під дією токсичних для клітини речовин. Суспензію клітин щільністю 5×105кл/мл культивували в ростовому середовищі з 10% ЕТС, що містить досліджувані речовини в різних концентраціях в 96-лункових планшетах. В контролі були клітини не оброблені препаратами. Кожну концентрацію речовини перевіряли в 3-4 повторах. Планшети з клітинами витримували в термостаті при 370С в 5% СО2 атмосфері протягом 48 годин.
Субстрат МТТ (Sigma, США) розчиняли ФСБ при кімнатній температурі до концентрації 5 мг/мл. Профільтрований розчин МТТ в обсязі 25 мкл вносили в лунки, що містять по 100 мкл клітинної суспензії і інкубували протягом 3-х годин при 370С в 5% СО2. Після інкубації, для осадження клітин, планшети центрифугували при 1500 об/хв протягом 10 хв і надосад видаляли. До осаду клітин в лунках додавали по 100 мкл 96% етанолу, в якому відбувалося розчинення кристалічного формазану. Після 10 хв ретельного струшування при 370С визначали оптичну щільність розчинів спектрофотометрично при довжині хвилі 540 нм на спектрофотометрі для планшетів Multiskan FC (Thermoscientific).
Відсоток пригнічення життєздатності клітин під дією препаратів визначали за кількістю утвореного формазану в дослідних зразках у порівнянні з контролем, який приймали за 100%.
Визначення ефективної дози (EC50)
EC50 представляє собою мінімальну концентрацію препарату, яка гальмує розвиток вірус специфічного ЦПД на 50%. Для визначення EC50 тест-вірус у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл вносили в культуру клітин і інкубували протягом 60 хв при 370С. Після адсорбції вірусу на клітинах, залишки його видаляли, клітини промивали живильним середовищем, після чого в підтримуюче середовище (RPMI-1640 + 2% фетальної сироватки) вносили препарати в різних концентраціях. Відсутність ЦПД в дослідженні (в оброблених культурах), при наявності його в контролі, а також різниця інфекційних титрів в досліді в порівнянні з контролем вірусу дозволяли встановити EC50 препарату.
Критерій оцінки антивірусної активності сполук в системах in vitro
Цитотоксичну концентрацію (СС50) – концентрацію препарату, яка сприяє зменшенню життєздатності культури клітин на 50% — визначали при аналізі цитотоксичної дії досліджуваних сполук відповідно до нормативних рекомендацій щодо досліджень антивірусних препаратів in vitro. Для визначення антивірусної активності досліджуваних речовин визначали ефективну концентрацію (ЕС50), тобто концентрацію досліджуваної речовини, при якій рівень реплікації вірусу в інфікованій культурі клітин пригнічується на 50% (1,5-2 lgID50 . Після визначення показників цитотоксичної і противірусної дії обчислювали індекс селективності (IS) як співвідношення СС50 до ЕС50. Досліджувані речовини, які мали IS ≥ 16 в системі in vitro вважали більш активними та перспективними для подальшого дослідження на тваринах.
Виявлення РНК вірусу трансмісивного гастроентериту свиней шт. D52 методом зворотної-полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР)
Виділення РНК виконували за допомогою набору «Рибо-сорб» відповідно до інструкції виробника (АмпліСенс, РФ).
Реакцію зворотної транскрипції виконували за допомогою набору «RevertAidTM H MinusFirstStrandcDNASynthesisKit» згідно до інструкції виробника (ThermoScientific, Литва). Для ПЛР були використані специфічні до гену нуклеопротеїна олігонуклеотидних праймерів наступної послідовності: прямий Uni_1 (5′-TGCACTGATCAATGTGCTAG-3 ‘) та зворотній Uni_2 (5’-TGAAAACACTGTGGCACCCTT-3″). Фрагмент, ампліфікуємого розміром 309 П.М. .. М — маркер «100 bpPlus DNA Ladder» («ThermoFisherScientific», Литва).
Статистична обробка результатів досліджень
Цифровий матеріал, представлений в роботі, оброблений варіаційно-статистично. Статистичну оцінку рівнів значуваності відмінностей отриманих цифрових показників проводили з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою програм MicrosoftExcel и MicrocalOrigin. Достовірними вважали відмінності при р <0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Характеристика вірусу трансмісивного гастроентериту свиней
Коронавіруси трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС) пасували на різних культурах характеризували по інфекційному титру. Результати представлені в таблиці.
Таблиця 1. Інфекційний титр вірусу ТГС в культурах клітин
| Культура клітин | Інфекційний титр БОЕ |
| ST5 | 3,9х107 БОЕ/мл; |
| СНЕВ100 | 3,1х107 БОЕ/мл; |
| НСП100 | 4,3х107 БОЕ/мл; |
| КЩЗ100 | 1,4х108 БОЕ/мл. |
Рис 3. Негативні колонії вірусу трансмісивного гастроентериту свиней шт. D52-100 КЩЗ.
Реакцію віруснейтралізаціі проводили в 96 лункових планшетах «Costar» (США), за методом H.Laude, з використанням в якості позитивного контролю референтної гіперімунної сироватки N6926, цього ж автора.
Виявлення РНК вірусу трансмісивного гастроентериту свиней шт. D52 методом зворотної-полімеразної цепної реакціі (ЗТ-ПЛР)
Виділення РНК виконували за допомогою набору «Рибо-сорб» згідно з інструкцією виробника (АмпліСенс, РФ).
Реакцію зворотної транскрипції виконували за допомогою набору «RevertAidTM H MinusFirstStrandcDNASynthesisKit» згідно з інструкцією виробника (ThermoScientific, Литва). Для ПЛР були використані специфічні до гену нуклеопротеїна олігонуклеотидних праймерів наступної послідовності: прямий Uni_1 (5′-TGCACTGATCAATGTGCTAG-3 ‘) і зворотній Uni_2 (5’-TGAAAACACTGTGGCACCCTT-3 «). Фрагмент, ампліфікованого розміром 309 П.М. .. М — маркер «100 bpPlus DNA Ladder» («ThermoFisherScientific», Литва). Вірус ТГС з різних культур пропасірували в культурі СНЕВ і провели аналіз продуктів ампліфікації проводився шляхом розподілу фрагментів ДНК в 1,5% гелі агарози.
| М | 1 | 3а | 4 | 6а | К- | М |
Рис. 4 Електрофоретичний аналіз продуктів ампліфікації вірусу трансмісивного гастроентериту свиней з праймером до гену нуклеопротеїна олігонуклеотидних праймерів наступній послідовності: прямий Uni_1 (5′-
TGCACTGATCAATGTGCTAG-3 ‘) і зворотній Uni_2 (5’-TGAAAACACTGTGGCACCCTT-3 «). Фрагмент, ампліфікованого розміром 309 П.М. .. М — маркер «100 bpPlus DNA Ladder» («ThermoFisherScientific», Литва).
М — маркер розмірів фрагментів РНК
№1 — штам коронавіруса Д52 із кк НСП
№3а — штам коронавіруса Д52 із кк СНЕВ
№4 — Д52 в культурі клітин ST- тестикул поросят
№6а — Д52 в культурі щитовидної залози свиней (КВЩ)
Визначення цитотоксичної дії досліджуваної комбінованої наносуспензії срібла та міді
Для визначення цитотоксичної концентрації досліджуваниї комбінованої наносуспензії срібла та міді використовували клітини СНЕВ, чутливі до вірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС). Використовували 96-лункові плашки, в яких вирощували клітини СНЕВ, через 24 години росту клітин з сформованим монощаром, ростове середовище в плашках видаляли і в лунки вносили по 100 мкл чистого середовища з антибіотиками. Досліджувану речовину комбіновану наносуспензію срібла та міді вносили у розведеннях від 5 до 100 мкг в 3-х повторах. Через 24 години проводили візуальну оцінку дії досліджуваних речовин і вносили МТТ-розчин для колорометричного визначення життєздатності клітин. Згідно візуальним спостереженням та тесту-МТТ для комбінованої наносуспензії срібла та міді показники СС50 представлені в таблиці 1.
Таблиця 1.
| Препарат | СС50 |
| Сu(10)+Ag(12) | 1:5 |
| Сu(10)+Ag(25) | 1:5 |
| Сu(20)+Ag(25) | 1:5 |
| Сu(40)+Ag(50) | 1:10 |
Дослідження антивірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді на моделі коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС)
Вплив комбінованої наносуспензії срібла та міді на репродукцію коронавірусу (ТГС) вивчали з використанням такої схеми введення препаратів:
— одночасне введення вірусу ТГС та досліджуваної комбінованої наносуспензії срібла та міді, тобто під час адсорбції ТГС на клітини.
Для вивчення антикоронавірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді використовували перещеплювану культуру клітин СНЕВ. Клітини вирощували в плашках на середовищі RPMI-1640 + 10% фетальної сироватки при температурі 370С в термостаті з подачею СО2.
Використовували штам вірусу трансмісивного гастроентериту свиней, з інфекційним титром 8,5 lg ІD50.
Для вивчення антивірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді відбирали добові культури клітин СНЕВ. Культуральну середу зростання зливали. Для визначення EC50 тест-вірус у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл вносили в культуру клітин і інкубували протягом 60 хв при 370С. Після адсорбції вірусу на клітинах, залишки його видаляли, клітини промивали живильним середовищем, після чого в підтримуюче середовище (RPMI-1640 + 2% фетальної сироватки) вносили препарати в різних концентраціях. Культури інкубували в термостаті з подачею СО2 протягом 5 діб, щодня контролюючи за допомогою мікроскопа і відзначаючи репродукцію вірусу по цитопатогенній дії ТГС на клітини СНЕВ в порівнянні з контрольними культурами вірусу ТГС, де моношар не піддавався ніяким впливам.
Цитопатогенну дію коронавірусу ТГС на клітини морфологічно проявляється в утворенні дрібноклітинної дегенерації.
Через 5 діб збирали культуральне середовище з лунок планшет і в ньому визначали інфекційний титр вірусу.
Визначення антикоронавірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді (ЕС50) в культурі клітин СНЕВ представлено в графіку.
Рис.5 Інфекційний титр вірусу ТГС в лунках оброблених різними розведеннями комбінованої наносуспензії срібла та міді і вірусом ТГС 100 ID50
Відповідно до отриманих результатів було встановлено, що досліджувані комбінованої наносуспензії срібла та міді статистично достовірно інгібує репродукцію коронавірусу ТГС на 2,0-3,0 lgID50 в різних концентраціях суміші наночастинок міді та срібла: для наносуспензії Cu (10)+ Ag (12) EC50 дорівнювало розведенню 1:200, Cu (10)+ Ag (25) EC50 дорівнювало розведенню 1:400, Cu (20)+ Ag (25) EC50 – 1:400, Cu (40)+ Ag (50) EC50 дорівнювало розведенню 1:400, тобто зростання концентрації нанометалів в композиціях нанометалів приводило до зростання їх антивірусноїефективності.
Критерієм оцінки інгібуючої активності антивірусних препаратів в системах in vitro є індекс селективності (IS) комбінованої наносуспензії срібла та міді і зниження інфекційного титру на 1,5-2,0 lgТЦД50. В таблиці представлені підсумовані результати досліджень по визначенню СС50, ЕС50, IS при введенні комбінованої наносуспензії срібла та міді.
Таблиця 2. Показники СС50, ЕС50, IS при визначенні антивірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді, в культурі клітин СНЕВ на моделі коронавірусу трансмісивного гастроентериту свиней.
| Назва препарату | СС50 мкг/мл | ЕС50 мкг/мл | IS | Інгібіція інфекційного титру в lgID50 |
| комбінованої наносуспензії срібла та мідіСu(10)+Ag(12) | 1:5 | 1:200 | 40 | 2,0 |
| комбінованої наносуспензії срібла та мідіСu(10)+Ag(25) | 1:5 | 1:400 | 80 | 2,0 |
| комбінованої наносуспензії срібла та мідіСu(20)+Ag(25) | 1:5 | 1:400 | 80 | 3,0-2,0 |
| комбінованої наносуспензії срібла та мідіСu(40)+Ag(50) | 1:10 | 1:400 | 40 | 3,0 |
ВИСНОВКИ
В результаті дослідження по вивченню антивірусної дії комбінованої наносуспензії срібла та міді на експериментальній моделі коронавірусу – вірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС) в культурі клітин СНЕВ було показано, що комбінованої наносуспензії срібла та міді ефективно інгібує репродукцію коронавірусу свиней на 2,0-3,0 lgID50 з індексом селективності 40,0-80,0, що свідчить про високий рівень антивірусної активності комбінованої наносуспензії срібла та міді на експериментальній моделі трансмісивного гастроентериту свиней.
